Panorama general de la determinación de micotoxinas

Para garantizar la inocuidad nutricional del ser humano y de los animales, sigue siendo crucial la detección y cuantificación de las micotoxinas en los alimentos para consumo humano y animal.El objetivo de este artículo es analizar y resumir las tendencias actuales en los métodos cromatográficos y brindarle al lector interesado un breve panorama general sobre el tema. En particular, la tremenda potencia de los instrumentos de espectrometría de masa con cromatografía de líquidos con respecto a su selectividad, sensibilidad y capacidad múltiple, hace que esta técnica goce cada vez de más popularidad para la determinación de contaminantes alimentarios, como las micotoxinas. Determinación de micotoxinas La determinación de micotoxinas sigue las tendencias generales de la química analítica. Esto incluye, además de métodos más rápidos y sensibles, la determinación simultánea de un mayor número de analitos en una sola medición. Aunque en el pasado, con regularidad solamente se monitoreaban las micotoxinas más prominentes, como las aflatoxinas, el deoxinivalenol (DON), las fumonisinas, la ocratoxina A o la zearalenona, hoy en día han ganado más popularidad los métodos múltiples. A menudo, estos métodos comprenden las llamadas micotoxinas "emergentes", que son los compuestos que últimamente se encuentran con más frecuencia. Entre los ejemplos se encuentran las toxinas del Fusarium: moniliformina, fusaproliferina o enniatinas (revisadas por Jestoi, 2008). También se pueden y deben monitorear los metabolitos vegetales solubles de las micotoxinas, las llamadas micotoxinas "enmascaradas" (revisado por Berthiller et al., 2013). Un ejemplo que sobresale es el deoxinivalenol-3-glucósido (D3G), el principal metabolito vegetal del DON, que en casos individuales puede incluso exceder la concentración de la toxina nativa en granos de cereales y a menudo sobrepasa la concentración de DON en cervezas (Varga et al., 2013a). Diferentes métodos de determinación En general, los métodos para la determinación de las micotoxinas se pueden dividir en métodos inmunoquímicos, cromatográficos y "otros", los cuales incluyen los de espectroscopia directa. En este artículo solamente se analizarán los métodos fundamentados en cromotografía de líquidos junto con la espectroscopia de masa en tándem (LC-MS o LC-MS/MS). Para revisiones más completas, se remite al lector interesado a la serie de actualizaciones anuales sobre "Desarrollos en el análisis de micotoxinas" publicados en World Mycotoxin Journal (por ejemplo, Shephard et al., 2013; Berthiller et al., 2014). Con respecto al uso de espectrometría de masa con cromatografía de líquidos (LC-MS) para la determinación de contaminantes químicos en los alimentos, recientemente se publicó una revisión crítica mucho más detallada (Hird et al., 2014). Los métodos más selectivos, sensibles y posiblemente también los más precisos de todos los que hay para la determinación de micotoxinas se basan en LC-MS, lo que permite también la inclusión de un número alto de analitos. El número de métodos para la determinación de micotoxinas desarrollados y publicados, que utilizan LC-MS, aumenta a un ritmo constante (véase la figura 1). Otras razones más de los métodos (múltiples) basados en LC-MS son las de cuantificar toxinas en mezclas de alimentos balanceados en lugar de matrices sencillas, usar un sólo método en lugar de muchos diferentes y monitorear los cambios en los patrones regionales de micotoxinas ocasionados por el cambio climático.Streit et al. (2013) destacan el poder y la necesidad de tales métodos múltiples basados en LC-MS/MS, lo que muestra la aplicación de un método que resulta en la detección de un total de 139 metabolitos secundarios diferentes (principalmente fúngicos) en una gran variedad de ingredientes de alimentos balanceados. El muestreo: principal desafío Para desarrollar buenos métodos múltiples basados en LC-MS/MS, se deben superar varios obstáculos. El principal desafío sigue siendo la recolección de una muestra representativa de granos, tomando en cuenta la distribución heterogénea de las micotoxinas en un lote. Aunque el muestreo sigue siendo la principal fuente de errores durante la determinación de micotoxinas, puede minimizarse la variabilidad con el aumento del tamaño de la muestra y submuestra, y la disminución del tamaño de partícula (Whitaker, 2006). Se han desarrollado planes de muestreo que van en función del tamaño del lote en general, que se han hecho cumplir por parte de la legislación (por ejemplo, la reglamentación 401/2006 de la CE ).Después de tomar y moler las muestras y submuestras, el siguiente obstáculo en el análisis multitoxinas es la extracción de la micotoxina. Ya que las micotoxinas son químicamente diversas y van desde las sustancias muy polares (por ejemplo, la moniliformina o el nivalenol) a las muy apolares (por ejemplo, beauvericina y enniatinas), es muy diferente su solubilidad en disolventes líquidos. Típicamente, se usa una mezcla de agua (acidificada) con disolvente orgánicos como el metanol, acetona o acetonitrilo (Sulyok et al., 2006), para extraer una cantidad grande de diferentes toxinas en un solo procedimiento. Cabe hacerse notar aquí que la extracción de una multitud de diferentes compuestos con una sola mezcla de disolventes tiene que ser un compromiso, además de que hay solventes más aptos para la determinación de analitos sencillos.También, debido a la diversidad química de las micotoxinas, están restringidas las opciones de limpieza de extractos. Aunque algunos métodos se basan en la separación de fases de las mezclas acetonitrilo-agua mediante la adición de sales (métodos parecidos a QuEChERS, Desmarchelier et al. 2010), el método más moderno simplemente diluye los extractos crudos antes de la medición, para disminuir la carga de la matriz.Ya que en un espectrómetro de masa solamente se pueden detectar iones, el siguiente paso importante es el proceso de ionización para los analitos neutrales, que por lo general se logra mediante interfaces de electroaspersión. Aunque son potentes y están en constante desarrollo, los dispositivos de electroaspersión son propensos a efectos de la matriz, lo que puede llevar a la supresión de señales o al mejoramiento de analitos que se coeluyen con compuestos de la matriz (Malachova et al., 2013). Detalles en el análisis Un método magnífico, eficiente y redituable para compensar los efectos de la matriz es el uso de micotoxinas etiquetadas con isótopos estables como estándares internos (Varga et al., 2012). Otras posibilidades incluye la calibración ajustada a la matriz, la adición o corrección estándar de las concentraciones medidas para la recuperación después de la validación cuidadosa de cada matriz.Los métodos más recientes son capaces de cuantificar alrededor de 300 metabolitos fúngicos en una gran variedad de diferentes ingredientes para alimentos balanceados y para consumo humano (Malachova et al., 2014) Un desafío técnico que hay que superar aquí es que se necesita de un cierto tiempo de residencia mínimo (de unos 10 ms) para la transición de monitoreo de reacción selectiva (SRM) de cada analito. Por cada toxina se tienen que medir dos de estas transiciones (cuantificador y calificador) para poder lograr la selectividad necesaria. Esto significa que para 300 toxinas (o 600 transiciones), cada transición se mediría sólo cada 6 segundos (con tiempos de residencia de 10 ms). Un pico típico de HPLC puede ser 20-30 s de ancho, mientras que los picos de UHPLC son incluso más angostos. Con mediciones de transiciones individuales de masa sólo cada 6 s, se obtendrían muy pocos datos del pico cromatográfico, lo que dificultaría gravemente la integración y cuantificación del pico. Los proveedores de LC-MS reaccionaron y desarrollaron modos SRM "dinámicos" (Varga et al., 2013b) o "programados" (Malachova et al., 2014). En dicho modos, se monitorean ciertas transiciones SRM sólo en ciertas ventanas de tiempo de retención, mientras que en otros tiempos se miden transiciones SRM de analitos que se esperan que se eluyan en estos tiempos de retención (véase la figura 2). Sensibilidad de detección de micotoxinas El desarrollo increíble con respecto a la sensibilidad de los instrumentos LC-MS se ejemplifica con el límite de detección del deoxinivalenol en los métodos múltiples basados en LC-MS/MS. En tres generaciones de espectrómetros de masa (todos de AB Sciex, EUA), se han conseguido los siguientes límites de detección en columna: 65 pg con un 2000 QTrap (Berthiller et al., 2005); 10 pg con un 4000 QTrap (Sulyok et al., 2006), 0.3 pg con un 5500 QTrap (Malachova et al., 2014). De esta manera, en el curso de 10 años los instrumentos han ganado un factor de 200 en sensibilidad. Espectrometría de masa de alta resolución Debe mencionarse aquí también que se pueden usar los métodos espectrométricos de masa de alta resolución (HR-MS) para la identificación y cuantificación de micotoxinas. Las ventajas de los instrumentos HR-MS, como el QTOFs o el Orbitraps, son la adquisición rápida de datos y el análisis de datos posterior a la adquisición. Esto último es una opción fascinante, ya que posteriormente se pueden también evaluar los contaminantes no considerados al momento de la medición.La precisión de alta masa de estos analizadores permite la generación de fórmulas de suma de muchas sustancias, que incluso posiblemente sean desconocidas. También es factible la identificación inequívoca de compuestos con MS/MS, incluso sin estándares, cuando se usan bases de datos adecuadas. La principal desventaja del instrumento HR-MS, además del costo, es que la sensibilidad es alrededor del 10 veces menor que los modernos sistemas LC-MS/MS triples cuádruples. Biomarcadores El uso de métodos de biomarcadores es una estrategia completamente diferente para evaluar la exposición de animales individuales a las micotoxinas. Tales métodos se basan principalmente también en LC-MS/MS y determinan la concentración de micotoxinas, sus metabolitos (biomarcadores de exposición) u otras sustancias endógenas afectadas (biomarcadores de efecto) en líquidos biológicos como la sangre o la orina.Las micotoxinas enmascaradas pueden reactivarse por la división del conjugado y la liberación de la toxina nativa en el tubo digestivo de los animales. Conclusiones Para concluir, el surgimiento de la espectrometría de masa ha llevado a muchas complicaciones con respecto a las micotoxinas en la última década. La selectividad, sensibilidad y velocidad de los modernos instrumentos LC-MS no solo resultan en la detección de toxinas nuevas y la cuantificación de micotoxinas desconocidas, sino que es la clave para también evaluar la exposición a las micotoxinas y la eficacia de los desactivadores de las mismas. Lea: Neutralizador de micotoxinas en pollos expuestos a toxina T-2 www.WATTAgNet.com/171559.html

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